細胞培養知識（一）

1 冷凍管應如何解凍？ 
取出冷凍管後， 須立即放入37 °C 水槽中快速解凍， 輕搖冷凍管使其在1 分鍾内全部融化， 並(bìng)注意水面不可超過冷凍(dòng)管蓋沿， 否則易發(fā)生污染情形。另冷凍(dòng)管由液氮桶中取出解凍(dòng)時， 必須注意安全， 預防冷凍管之爆裂。 

2 細胞冷凍管解凍培養時， 是否應馬上去除DMSO？ 
除少數特别注明對DMSO 敏感之細胞外， 絕(jué)大部分細(xì)胞株（包括懸浮性細(xì)胞）， 在解凍之後， 應直接放入含有10-15ml新鮮(xiān)培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中
， 待隔天再置換(huàn)新鮮(xiān)培養基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解凍(dòng)後細胞無法生長(zhǎng)或貼附之問題。 

3 可否使用與原先培養(yǎng)條(tiáo)件不同之培養(yǎng)基？ 
不能。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已适應之細(xì)胞培養(yǎng)基， 若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條(tiáo)件不同之培養(yǎng)基， 細(xì)胞大都無(wú)法立即适應， 造成細胞無法存活。 

4 可否使用與原先培養條(tiáo)件不同之血清種類(lèi)？ 
不能。血清是細胞培養上一個(gè)極(jí)爲重要的營養來源， 所以血清的種類和品質對於(yú)細胞的生長會産(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清， 在一些物質或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用錯(cuò)誤常會(huì)造成細胞無法存活。 

5 何謂FBS, FCS, CS, HS ? FBS （fetal bovine serum） 和FCS （fetal calf serum） 是相同的意思
， 兩者都是指胎牛血清， FCS 乃錯誤的使用字眼， 請不要再使用。CS （calf serum） 則是指小牛血清
。HS （horseserum） 則是指馬血清。
 
6 培養細胞時應使用5 % 或10% CO2？或根本沒有影響？ 
一般培養基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作爲pH 的緩沖系統， 而培養基中NaHCO3 的含量将決(jué)定細胞培養時(shí)應使用的CO2 濃度。當培養基中NaHCO3 含量爲每公升3.7 g 時，細胞培養時應使用10 % CO2；當培養基中NaHCO3 爲每公升1.5 g 時， 則應使用5 % CO2 培養細胞。

7 何時須更換培養基？ 
視細胞生長密度而定， 或遵照細胞株基本數據上之更換(huàn)時間(jiān)，按時更換(huàn)培養基即可。
 
8 培養(yǎng)基中是否須(xū)添加抗生素？ 
除於特殊篩選系統中外， 一般正常培養狀态下， 培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。
 
9 附著性細胞繼代時所使用之trypsin-EDTA 濃度？應如何處理？ 一般使用之trypsin-EDTA 濃度爲0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。*次開瓶後(hòu)應立即少量分裝於(yú)無菌試管中， 保存於-20 °C，避免反複冷凍解凍造成trypsin 之活性降低， 並可減少污染之機會。 

10 懸浮性細胞應如何繼(jì)代處(chù)理？ 
一般僅(jǐn)需持續加入新鮮培養基於(yú)原培養角瓶中
， 稀釋細胞濃度即可， 若培養液太多時， 可将培養(yǎng)角瓶口端稍微擡(tái)高， 直到無法容納(nà)爲止。分瓶時(shí)取出一部份含細胞之培養液至另一新的培養角瓶， 加入新鮮培養基稀釋至适當(dāng)濃(nóng)度， 重複前述步驟即可。 

11 欲将一般動(dòng)物細胞離心下來(lái)，其離心速率應爲多少轉速？
欲回收動物細胞， 其離心速率一般爲300xg （約1,000rpm），5 - 10 分鍾， 過高之轉速， 将造成細胞死亡。 

12 細胞之接種密度爲何？ 
依照細胞株基本數據(jù)上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細胞數太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長(zhǎng)之一重要原因。 

13 細胞冷凍(dòng)培養基之成份爲(wèi)何？ 
動(dòng)物細胞冷凍(dòng)保存時zui常使用的冷凍(dòng)培養基是含5 - 10 %DMSO （dimethyl sulfoxide） 和90 - 95 % 原來細胞生長(zhǎng)用之新鮮培養基均勻混合之
。注意
：由於(yú)DMSO 稀釋時會(huì)放出大量熱(rè)能， 故不可将DMSO 直接加入細胞液中， 必須(xū)使用前先行配制完成。 

14 DMSO 之等級(jí)和無菌過(guò)濾之方式爲何？ 
冷凍保存使用之DMSO 等級
， 必須爲Tissue culture grade之DMSO （如Sigma D2650）， 其本身即爲無菌狀況， *次開瓶後(hòu)應立即少量分裝於(yú)無菌試管中， 保存於4°C， 避免反複冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質， 並(bìng)可減少污染之機會。若要過(guò)濾DMSO， 則須使用耐DMSO 之Nylon 材質濾膜。 

15 冷凍保存細胞之方法？ 
冷凍保存方法一: 冷凍管置於4 °C 30~60 分鍾→ （-20 °C30 分鍾*） → -80 °C 16~18 小時（或隔夜） → 液氮槽vaporphase 長期儲存。 冷凍保存方法二: 冷凍(dòng)管置於(yú)已設定程序之可程序降溫機中每分鍾降1-3 °C 至-80 °C 以下
， 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 °C 不可超過1 小時， 以防止冰晶過(guò)大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過(guò)此步驟直接放入-80°C 冰箱中，惟存活率稍微 降低一些。 

16 細胞欲冷凍保存時， 細胞冷凍(dòng)管内應有多少細胞濃(nóng)度？
 冷凍管内細胞數目一般爲1x106 cells/ml vial， 融合瘤細胞則以5x106 cells/ml vial 爲宜。 

17 應如何避免細胞污染？ 
細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、黴菌
、病毒和黴漿菌。主要的污染原因爲無菌操作技術不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細胞等。嚴格之無菌操作技術、清潔的環(huán)境、與品質良好之細胞來源和培養基配制是減低污染之方法
。 

18 如果細胞發(fā)生微生物污染時，應如何處(chù)理？ 
直接滅菌後丢棄之。 

19 支原體（mycoplasma） 污染的細胞， 是否能以肉眼觀察出異狀？ 
不能。除極(jí)有經(jīng)驗之專家外，大多數遭受支原體污染的細胞株， 無法以其外觀分辨之。 

20 支原體污染會(huì)對(duì)細胞培養有何影響？ 
支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長(zhǎng)參(cān)數， 代謝及研究之任一數據(jù)。故進行實驗前，必須確(què)認細胞爲mycoplasma-free，實驗結(jié)果之數據(jù)方有意義。 

21 偵測(cè)出細胞株有支原體污染時(shí)， 該(gāi)如何處(chù)理？直接滅菌後丢棄，以避免污染其它細胞株。 

22 CO2 培養箱之水盤(pán)如何保持清潔(jié)？ 
定期（至少每兩周一次） 以無菌蒸餾水或無菌去離(lí)子水更換(huàn)之。 

23 爲何培養基保存於4 °C 冰箱中， 顔色會偏暗紅色， 且pH值會越來越偏堿性？ 
培養基保存於4 °C 冰箱中
， 培養基内之CO2 會(huì)逐漸溢出
，造成培養基越來越偏堿性。而培養基中之酸堿指示劑(jì)（通常爲phenol red） 的顔色也會(huì)随堿性增加而更偏暗紅(hóng)。培養基偏堿之結果， 将造成細胞生長(zhǎng)停滞或死亡。若培養基偏堿(jiǎn)時， 可以通入無菌過濾之CO2， 以調整pH 值。 

24 各種細胞培養用的dish，flask是否均相同？ 
不同廠牌的dish 或flask， 其所coating 的polymer 不同， 制造程序亦不同， 雖對(duì)大部分細胞沒(méi)有太大之影響， 惟少數(shù)細胞則可能因使用廠(chǎng)牌不同之dish 或flask 而有顯著之生長差異。 

25 購買之細胞冷凍(dòng)管經解凍(dòng)後，爲何會發(fā)生細胞數目太少之情形？ 
研究人員在冷凍(dòng)細胞之培養時(shí)出現細胞數目太少， 大都是因爲離(lí)心過(guò)程操作上的失誤
， 造成細胞的物理性損傷， 以及細胞流失。建議細胞解凍(dòng)後(hòu)不要立刻離心， 應待細胞生長(zhǎng)隔夜後(hòu)再更換培養基即可。 

26 購(gòu)買(mǎi)之細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因？ 
研究人員在細(xì)胞培養時(shí)出現存活率不佳， 常見原因可歸納爲：培養基使用錯(cuò)誤或培養基品質不佳。血清使用錯(cuò)誤或血清的品質不佳。解凍(dòng)過程錯(cuò)誤。冷凍(dòng)細胞解凍(dòng)後， 加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認爲死細胞。培養溫度使用錯(cuò)誤。細胞置於(yú)-80 °C 太久。 

27 收到之冷凍(dòng)管瓶身破裂，瓶蓋(gài)有裂紋，或瓶蓋(gài)脫落之原因？ 
冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂，可能是因爲操作者夾取冷凍管時用力不當(dāng)，造成冷凍管裂損，建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動或松脫，乃因熱脹冷縮之物理現象，冷凍管有可能因此而造成細胞污染，故冷凍管於(yú)放入和取出液氮桶時，均應立刻将冷凍管再一次扭緊。